酶聯(lián)免疫試劑盒是將已知的抗原或抗體吸附在固相載體(聚苯乙烯微量反應(yīng)板)表面，使酶標(biāo)記的抗原抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行，用洗滌法將液相中的游離成分洗除。常用的ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)）法有雙抗體夾心法和間接法，前者用于檢測(cè)大分子抗原，后者用于測(cè)定特異抗體。

　　今天我們?yōu)榇蠹以敿?xì)解說酶聯(lián)免疫試劑盒檢測(cè)方法：

　　首先我們要從抗體的酶標(biāo)記及質(zhì)量鑒定、抗原濃度的優(yōu)化、洗滌液及保護(hù)液的優(yōu)化、酶標(biāo)抗體稀釋度的優(yōu)化、底物液的優(yōu)化、底物作用時(shí)間的優(yōu)化，然后比較結(jié)果。

　　一、抗體的酶標(biāo)記及質(zhì)量鑒定：試劑盒收集第一峰即為酶標(biāo)抗體峰。標(biāo)記完后用紫外分光光度計(jì)在分別在280nm、及403nm處測(cè)定酶標(biāo)記物的A值，計(jì)算免疫球蛋白量、摩爾比值、酶結(jié)合率以及標(biāo)記率。

　　二、包被用緩沖液及最適包被抗原濃度的優(yōu)化：

　　1.包被緩沖液的優(yōu)化：三種緩沖液作為包被液，抗原包被濃度為5ug/ml，及2.5ug/ml,酶標(biāo)抗體工作濃度為1：400及1：300，用自動(dòng)酶標(biāo)儀分析，選擇最佳的包被緩沖液系統(tǒng)。

　　2.最適抗原包被濃度的優(yōu)化：顯色的強(qiáng)度在一定范圍內(nèi)與包被的抗原量成正比，但隨著包被抗原濃度的增加，顯色的強(qiáng)度反而降低，我們選擇臨界包被值作為包被抗原量。

　　三、封閉液、洗滌液及保護(hù)液的優(yōu)化

　　1.封閉液的優(yōu)化：采用文獻(xiàn)報(bào)道的方法進(jìn)行封閉，其封閉液的組成為：10mM磷酸鹽緩沖液含1%的牛血清白蛋白。

　　2.洗滌液的配制：采用文獻(xiàn)報(bào)道的方法配制洗滌液。

　　四、酶標(biāo)板保護(hù)液的優(yōu)化：在封閉完后加入保護(hù)液于4℃冰箱中孵育放置一個(gè)晚上，同時(shí)與未做保護(hù)的酶標(biāo)板進(jìn)行對(duì)照，然后將保護(hù)的及未保護(hù)的酶標(biāo)板置于37烘箱中放置15天，考察保護(hù)液對(duì)酶標(biāo)板的穩(wěn)定性的影響。

　　五、酶標(biāo)抗體稀釋度、保護(hù)液的優(yōu)化

　　1.稀釋度的優(yōu)化：抗原包被濃度為4ug/ml，經(jīng)孵育、洗滌后、顯色終止后，用自動(dòng)酶標(biāo)儀分析，選擇A值為1.5左右的酶標(biāo)抗體稀釋度為最適工作濃度。

　　2.保護(hù)液的優(yōu)化：適當(dāng)?shù)木彌_液以及添加無關(guān)蛋白質(zhì)、糖、防腐劑以及一些含氨基的化合物等都會(huì)對(duì)對(duì)酶標(biāo)抗體的活性起一定的保護(hù)作用，因此我們?cè)O(shè)計(jì)了一組保護(hù)劑用于保護(hù)酶標(biāo)抗體，與未添加任何糖蛋白的酶標(biāo)抗體做對(duì)照。